Hematology Lab - 06 Peripheral Blood Smear

          HEMATOLOGY LABORATORY  PERIPHERAL BLOOD SMEAR   OUTLINE  •   Peripheral Blood Smear  o   Wedge Technique  o   Fixing and Staining  o   Well-made Wedge/PBS Smear  o   Normal vs. Poorly Made PBS  o   Optimal Assessment Area  o   WBC Estimate  o   Platelet Estimate      PERIPHERAL BLOOD SMEAR  •   The examination of the peripheral blood smear is an integral part of the routine examination of blood films. Essential information can be obtained from this examination.  o   Information regarding RBC, WBC, platelets  o   Determines health status  WEDGE TECHNIQUE  •   aka Double slide, spreader slide, or push smear  •   The most convenient and most commonly used PBS preparation method.  •   Uses :  o   WBC (HPF/40x) & Platelet Count Estimate (OIF/100x)  o   WBC Differential Count (OIF/100x)  o   nRBC count (OIF/100x)  •   Specimen : EDTA Whole Blood   o   Prepared within 2-3 hours after collection  o   Heparin -  not used, stains the smear too blue   MATERIALS  •   Glass slides  o   Film slide  o   Spreader slide (smooth edged)  o   May be frosted (for labelling)  •   Methanol  (fixative)  o   Preserve morphology  •   Romanowsky stain  (nonvital polychrome stain)  o   Non-vital Stains dead cels  o   Polychrome - more than one stain  o   Uses acidic and basic stain  o   Eosin - acidic  o   Methylene blue - basic  o   Uses phosphate buffer (6.4 - 6.8 pH)  •   Microscope  (visualization)  •   Oil immersion  o   Cedarwood Oil  PROCEDURE    •   Add a drop of blood places .25 inch from one end of the slide. Drop should be 2-3 mm in diameter.   o   Large drop - thicker smear  o   Small drop - thinner smear  •   Place the spreader slide at a 30-45° angle in a place near the drop but not touching the blood.  •   Draw back the slide until it touches the blood. Allow the blood to spread across the width of the slide.  •   Push the slide quickly at the other end. Use even pressure when pushing.  o   Length of smear should 2/3 - ¾ of length of the slide.    FACTORS AFFECTING PBS THICKNESS/THINNESS    Thick Smear  Thin Smear  Size of Blood Drop  Large drop  Small drop  Angle of Spreader  Slide  Increased angle  Decreased angle  Pressure exerted  Heavy pressure  Light pressure  Speed  Too fast  Too slow  Hematocrit  Increased Hct  Decreases Hct  •   Corrective action  o   ↑ Hct, decrease spreader angle or use small drop  o   ↓ Hct, increase angle of spreader or use large drop  FIXING AND STAINING  •   Procedure  1.  Immerse slide with fixative (methanol) and air dry  ▪   Alcohol allow fast air drying  2.  Immerse in Methylene blue then in Eosin  ▪   No need for washing before  3.  Wash excess stain with water  ▪   Wash at backside of slide  4.  Air dry  WELL-MADE WEDGE/PBS SMEAR  MACROSCOPIC CHARACTERISTICS  •   The film is 2/3 to 3⁄4 of the length of the slide  o   Widely distributed  •   Film is finger shaped (very slightly rounded feathery edge)  •   The lateral edges are visible  •   The film is smooth (no irregularities, holes, streaks, etc)  o   Ensures well-distributed cells  •   Presence of “rainbow” appearance in the feathery edge of the film   

          MICROSCOPIC CHARACTERISTICS  •   Pink to purple color of smear  o   Heparin make smear bluish  •   RBC   – orange to salmon pink  •   WBC nuclei   – pink to purple  o   Neutrophils  - pink with violet or lilac granules  o   Eosinophils   – bright orange refractile granules  o   Basophil   – purplish black granules  o   Lymphocyte   – robin’s egg blue cytoplasm, compact  nucleus  o   Monocyte  - faint blue gray cytoplasm  •   Platelets   – purple blue to lilac with cytoplasm containing  red blue granules  •   The area between cells should be colorless, clean, and free of stain precipitate  ACCEPTABLE VS UNACCEPTABLE PBS    •   Chipped/rough edge - caused by spreader slide  •   Streaks - due to uneven pressure  •   Bubbles - may have increased lipids  POORLY STAINED SMEAR  Problems  Causes  RBCs - gray WBCs - too dark Eosinophil granules - gray  •   Stain or buffer too alkaline  •   Inadequate rinsing  •   Prolonged staining  •   Heparinized blood specimen  •   Short drying period  •   Too alkaline washing water  •   Old smear  WBCs - too pale or red WBCs - barely visible  •   Stains or buffer too acidic  •   Underbuffering  •   Excessive rinsing    MICROSCOPIC EXAMINATION  •   10x Objective Examination (LPO)  o   Assessment of overall film quality, color, and distribution of cells  o   Selection of optimal assessment area  •   40x Objective Examination (HPO)  o   WBC estimation (use 10 fields)  •   100x Objective Examination (OIO)  o   Platelet Estimate Count (use 10 OIO fields)  o   WBC Differential Count (100 cells)  ▪   Battlement Method (Back-and-forth Serpentine)  OPTIMAL ASSESSMENT AREA  •   Macroscopically :  o   Area between the thick area and the very thin area (feathered edge)  •   Microscopically :  o   RBCs are uniformly and singly distributed, with few touching or overlapping, and have their normal biconcave appearance (with central pallor)  •   Approx. 200-250 RBC per OIF    AREAS TO AVOID  •   Feathered edge  (thin area)   o   RBC:  ▪   Macrocytic  ▪   Lacks central pallor (spherocytic)  ▪   Flattened  o   Distorted WBCs  •   Thick part  o   RBC appear microcytic  o   Artifactual rouleaux (stacked coin pattern)    feathered edge         thick part  WBC ESTIMATE  •   Count WBC in 10 consecutive HPF  •   Check result of automated analyzer  •   Formula :  WBCΤuL = Ave. WBC counted x 2,000  # of WBCs/HPF  Estimated WBC count  2  – 5 WBCs/hpf  4,000  – 7,000 WBCs/uL  4  – 6 WBCs/hpf  7,000  – 10,000 WBCs/uL  6  – 10 WBCs/hpf  10,000  – 13,000 WBCs/uL  10  – 20 WBCs/hpf  13,000  – 18,000 WBCs/uL 

          PLATELET ESTIMATE  •   Count platelets in 10 consecutive OIF  •   Formula :  PltsΤuL = ave. # of platelets x 20,000  •   Platelet Estimate Reporting  Platelet Estimate  Reporting  0  – 49,000/uL  Marked decrease  50,000  – 99,000/uL  Moderate decrease  100,000  – 149,000/uL  Slight decrease  150,000  – 199,000/uL  Low Normal  200,000  – 400,000/uL  Normal  401,000  – 599,000/uL  Slight increase  600,000  – 800,000/uL  Moderate increase  >800,000/uL   Marked increase    WBC DIFFERENTIAL COUNT  •   Percentage of each type of WBC in the blood:  o   Neutrophils  o   Lymphocytes  o   Monocytes  o   Eosinophils  o   Basophils  •   Specific WBC type is counted using peripheral blood smear (100x objective)    •   Procedure  1.  Prepare a well-made and stained PBS 2.  Using OIO, identify 100 WBC based on type 3.  Express result as percentage or as absolute count.  WBCs  Granulocyte  Cell Size  Cytoplasm  Nucleus  Segmented Neutrophils/ PMN  (mature)  9-15 um    With fine lilac- pink  granules    Multilobed (2-5)  connected by  thin filaments  Band/Stab/ Staff  (youngest granulocytic precursor)  9-15 um  Indented nucleus   (>1/2 of nuclear  diameter)  S, C, Z shaped  Sausage-shaped  Eosinophil  9-15 um  With coarse  reddish-  orange granules  Bilobed  Basophil       10-16 um  With coarse bluish-black   granules that  obscure the  nucleus  Multilobes (3-4)    Agranulocyte  Cell Size   Cytoplasm   Nucleus   Small Lymphocyte  7-10 um  Sky-blue (Robin  egg blue)  No granules  Compact, large  and round  Large/Big/ Atypical Lymphocyte   11-25 um  Sky-blue (Robin  egg blue)  No granules  Indented by RBC  Immature looking  (round, oval, or  slightly  indented)  Agranulocyte  Cell Size   Cytoplasm   Nucleus   Monocyte     14-20 um  Blue-gray with  ground glass  appearance  with/out vacuoles  Kidney-shaped ,  horshoe/coffee  bean with brain- like convolutions    •   Small & large lymphocyte are only counted as one  MANNER OF REPORTING  •   Relative Count  o   The number of specific WBC type per 100 WBCs  o   Formula :    •   Absolute Count  o   Gives the number of specific WBC type per cubic millimeter of blood  o   More informative than Relative count  o   Formula :    •   Reference Ranges :    RELATIVE  COUNT (%)  ABSOLUTE  COUNT(/mm3)  NEUTROPHIL  47  – 77%  1,600  – 7,260  BAND/STAFF/STAB  2  – 6%  350 - 700  LYMPHOCYTE  20  – 40%  960  – 4,400  MONOCYTE   2  –10%  180  – 880  EOSINOPHIL  0  – 6%  45  – 440  BASOPHIL   0  – 1%  45  – 110   METHODS  •   100-cell differential   – Routinely performed method of  differential count  •   50-cell differential   – performed only if WBC count is <1.0  x 10 9 /L  o   Use buffy coat smear  o   In cases of leukopenia  o   Result is multiplied by 2  •   200-cell differential   – performed only if:  o   Leukocytosis  o   Eosinophil = >10%  o   Basophil = >2%  o   Monocytes = >11%  o   Lymphocytes > Neutrophils (among adults)  •