Hematology Lab - 05 Reticulocyte Count

          HEMATOLOGY LABORATORY  RETICULOCYTE COUNT   OUTLINE  •   Reticulocytes  •   Reticulocyte Count  •   Supravital Stain  •   Sources of Error  •   Reticulocytosis    •   Absolute Reticulocyte Count (ARC)  •   Corrected Reticulocyte Count (CRC)  •   Reticulocyte Production Index (RPI)   RETICULOCYTE COUNT  RETICULOCYTES  •   The last immature erythrocyte stage  o   Last stage normally present in the blood  o   Wright stain - polychromatic erythrocyte  o   Supravital stain - reticulocyte  •   Stained darkly with RNA remnants and organelles (mitochondria & ribosomes)  •   Assess erythropoietic activity of bone marrow  •   Spend 2-3 days in Bone marrow, and 1 day in peripheral blood before developing into a mature RBC.  •   Reference Range :  o   Newborn : 1.5-5.8%  o   Adult : 0.5-1.5%   RETICULOCYTE COUNT  •   Index for evaluating effectiveness of erythropoiesis.  o   Erythropoiesis - occur in bone marrow  •   “Poor Man’s Bone Marrow”  o   Assess bone marrow response to stimulus without studying bone marrow  •   Importance:  1.  Confirm diagnosis of pernicious anemia by  therapeutic response  2.  Determines response of pernicious anemia patient to  vitamin B12 therapy  3.  Aids in diagnosis of lead poisoning & hemolytic anemia 4.  To determine whether there is normal RBC  regeneration  5.  To aid in the prognosis of acute hemorrhage. An  increase reticulocyte count indicates RBC regeneration.  •   Principle : Whole Blood is stained with supravital stain.  Any non-nucleated erythrocyte that contains two or more particles of blue-stained granulofilamentous material is a reticulocyte.  o   Polychromatophilic erythrocyte are only reported  o   Blue filaments - precipitated inclusions (remnants, organelles, iron stores        MATERIALS  •   Specimen : EDTA-anticoagulated whole blood or capillary  blood  •   EDTA tube  •   Cotton balls  •   0% isopropyl alcohol  •   Binocular microscope  •   Calibrated Miller Disk  •   Supravital Stain (New Methylene Blue, Brilliant Cresyl Blue)  o   New Methylene Blue - more preferred  •   Glass slides  •   Cedarwood oil (for OIF)  DRY METHOD  •   Procedure :  1.  Mix equal amounts of EDTA whole blood and  supravital stain (2-3 drops each).  2.  Incubate for 3-10 minutes at room temperature 3.  Remix the preparation  ▪   Reticulocyte has tendency to settle at the top (due to low specific gravity)  ▪   Inability to remix may cause false decrease  4.  Prepare a blood smear  ▪   Allow slide to dry  5.  Count 1000 RBC/Reticulocyte under OIF.  ▪   RBC and reticulocyte are counted as one  •   Formula :    •   Sample Problem : 23 reticulocytes are counted per 1000  RBC observed.  o   23 Reticulocytes  o   977 RBC    WET METHOD  •   Rapid method of Schilling, Osgood-Wilhelm, and Sabin  o   Smear is not allowed to dry  •   Procedure:  1.  Place a drop of freshly filtered stain on a clean glass  slide.  2.  Add an equal volume of blood. Mix by stirring. 3.  Cover the mixture with a clean coverslip lined with  Vaseline.  4.  Proceed with counting. (same counting as dry method)  MILLER DISC METHOD  •   Miller Disc   – an optical aid inserted into  the eyepiece of microscope. The disc ruling is composed of a center square (Square A) containing a secondary square (Square B).  o   Square B   – 1/9 of the total area of Square A 

          •   The method was developed to simplify counting by minimizing the number of cells counted.  •   Procedure :  1.  Prepare blood smear using dry method. 2.  Count reticulocytes in the entire Square A 3.  Count at least 112 RBCs in Square B  ▪   RBC & reticulocytes are counted as 1  •   Formula :    SUPRAVITAL STAIN  •   Mature RBC   – gray blue  •   Reticulocytes   – gray blue cells with deep blue  filamentous web or granules (2 or more)    SOURCES OF ERROR  •   Failure to mix blood and stain completely  •   Presence of refractile artifacts  •   Increased blood glucose level  •   Presence of pappenheimer bodies, Heinz bodies, and Howell-Jolly bodies.  o   These are also stained with supravital stain.  RETICULOCYTOSIS  •   Increased reticulocytes in the blood  •   Seen in :  1.  Hemolytic Anemia 2.  Lead Poisoning 3.  Iron Deficiency Anemia 4.  Acute and Chronic Blood  Loss  5.  Thalassemia 6.  Sideroblastic Anemia 7.  Malaria 8.  Parasitic Infections  9.  Blood intoxication 10. Kala-azar 11. Erythroblastic anemia 12. Sickle cell anemia 13. Relapsing fever 14. Leukemia 15. Myeloproliferative  disorder  16. Splenic tumor  o   Anemia  - decrease in Hgb; marrow compensates by  releasing reticulocytes   CHANGES IN RETICULOCYTE COUNT  •   Physiologic Increase in Reticulocyte Count  o   Pregnancy  o   At birth  o   Menstruation  o   High altitudes  •   Decreased Reticulocytes :  o   Aplastic anemia - blood cells are not produced by bone marrow  o   Bone Marrow Failure  o   Acute benzol poisoning  o   Chronic infections    ABSOLUTE RETICULOCYTE COUNT (ARC)  •   Actual number of reticulocytes in 1 liter of whole blood  •   Computation :    •   Reference Range : 25-75 x 10 9 /L  •   Sample Problem : If patient’s reticulocyte count is 3.6%  and the RBC count is 3.20 x10 12 /L. What is the ARC?    CORRECTED RETICULOCYTE COUNT (CRC)  •   aka Reticulocyte Index or Hematocrit Correction  •   In specimens with low Hematocrit, the percentage of retics may be falsely elevated because whole blood contains fewer RBCs.  •   Correction Factor : 45%  •   Computation :    RETICULOCYTE PRODUCTION INDEX (RPI)  •   aka Shift Correction  •   Provides further refinement of the CRC  •   Measures erythropoietic activity when stress/shift reticulocytes are present.  o   Stress/Shift Reticulocyte  - premature reticulocytes  that are released from the bone marrow to compensate for anemia  •   Formula:    •   Maturation Index:  HEMATOCRIT (%)  MATURATION INDEX (days)  40  – 45  1  35  – 39  1.5  25  – 34  2  15  – 24  2.5  <15  3  •   Sample Problem:  A patient with reticulocyte count of 3.6%  has a hematocrit level of 29.6%. Compute for CRC and RPI.