Hematology Lab - 02 Hemocytometry

          HEMATOLOGY LABORATORY  HEMACYTOMETRY   OUTLINE  •   Hemacytometry  •   Materials  •   WBC Secondary Squares  •   RBC Secondary Squares  •   Procedure      HEMACYTOMETRY  •   Manual quantitative evaluation of formed elements of the blood (RBC, WBC, Platelets).   •   Principle :   o   A small measured quality of blood is diluted with fluid (diluting fluid), which prevent coagulation, preserves the cell type to be counted, and eliminates the other cell types. The diluted blood is placed in a counting chamber and the number of cells in a known volume is counted with microscope.  MATERIALS  •   Compound microscope  •   Thoma pipettes/ diluting pipettes   o   RBC pipette  - manual RBC counting  o   WBC   pipette  - manual WBC counting  •   Diluting fluid  •   Counting chamber/Hemacytometer  •   Coverslip  THOMA PIPETTE  •   aka Diluting pipette  •   Used to contain the blood sample to be diluted with diluting fluid    RBC pipette  WBC pipette  Use   For manual RBC  counting  For manual  WBC counting  Markings   0.5, 1, 101  0.5, 1, 11  Color of bead   Red  White  Volume in the bulb   100  10          •   Shaft - elongated part before bulb  •   Bulb - bulged part in the middle  •   Volume    RBC pipette  WBC pipette  Shaft volume  1  1  Bulb volume  100  10  Total Volume  101  11      •   Syringe barrel  - aspirator for pipette  DILUTING FLUID  •   This lessen the concentration of blood sample in order to disperse the blood cells and facilitate its counting under the microscope  •   Criteria :  o   RBC diluting fluid  -  isotonic   ▪   Preserve morphology and structure of RBCs  ▪   Preservation allow proper and accurate counting  o   WBC diluting fluid  -  hypotonic   ▪   Hypotonic solution lyses RBC to leave WBC  o   Platelet diluting fluid   –  must preserve platelet  integrity and inhibits aggregation   ▪   Platelet has tendency to become dysmorphic & clumped  ▪   Stains platelet for easy visualization  o   Has good preservative property  ▪   Should not initiate growth of mold & yeast  o   Does not initiate growth of molds/yeasts  o   High specific gravity  o   With buffering action  o   Cheap and easy to prepare       Shaft  Bulb 

          COUNTING CHAMBER  •   aka hemacytometer/hemocytometer  •   “heart” of manual blood cell counting  •   Improved Neubauer Counting Chamber  o   The most commonly used counting chamber  IMPROVED NEUBAUER COUNTING CHAMBER  •   Characteristic:  o   Depth : 0.1 mm (1/10 mm)  ▪   Distance between counting chamber & coverslip  o   Has two counting area (primary square)  ▪   Area :  •   Primary Squares : 9.0 mm each  •   Secondary Squares : 1.0 mm each  o   4 corner secondary squares   – used  for manual WBC counting  ▪   Subdivided into 16 tertiary square  o   1 central secondary squares   – used  for manual RBC counting  ▪   Subdivided into 25 tertiary square  ▪   Each RBC tertiary squares are further divided into 16 quaternary squares      WBC SECONDARY SQUARES  •   4 corner secondary (2°) squares      AREA OF WBC SQUARES  •   1° square : 9.0 mm 2   •   2° square : 1.0 mm 2   •   WBC 3° square :  o   16 per 1 secondary square  o   Area : 0.0625 mm 2     RBC SECONDARY SQUARES   

              AREA OF RBC SQUARES  •   1° square : 9.0 mm 2   •   2° square : 1.0 mm 2   •   RBC 3° square :  o   25 per central 2° square  o   Area : 0.04 mm 2   •   RBC 4° square :  o   16 per RBC 3° square  o   Area : 0.0025 mm 2     PROCEDURE  1.  Draw blood up to the 0.5 mark of the thoma pipette  (RBC/WBC)  2.  Wipe the tip of the thoma pipette  o   To prevent blood contamination of diluting fluid  3.  Draw diluting fluid up to the mark above the bulb of the  pipette (RBC: 101; WBC: 11)  4.  Shake the pipette for 5 minutes 5.  Discard few drops (1-2 drops)  o   To remove fluid in the shaft  o   Fluid in the shaft may be pure diluting fluid  6.  Charge the counting chamber 7.  Stand for 3 minutes  o   Ensures that blood cells are no longer moving  8.  Count cells on both counting area  o   RBC count: 5 tertiary RBC squares (4 corners, 1 central)  o   WBC count: 4 secondary WBC squares (4 corners)  o   Get sum/total cells in squares in 1 counting area  o   Get average of the total cells in both counting area    RBC                                       WBC    GENERAL FORMULA  •   Cell count  = # of cell counted x dilution factor                                        Depth x Area   o   Dilution factor  - reciprocal of dilution  Computation in RBC pipette  0.5 - blood 101 - total volume 0.5:101 = 1:202 - initial dilution 1:200 - final dilution (due to discarding diluting fluid)  Computation in WBC pipette  0.5 - blood 11 - total volume 0.5:11 = 1:22 - initial dilution 1:20 - final dilution (due to discarding diluting fluid)  •   Unit : cells/mm 3   •   Note :  o   Count WBC or RBC on both counting area (primary square) of the hemacytometer and get the average.  o   Allowable difference between two chambers:  ▪   RBC: 15-16 counts  ▪   WBC: 10-12 counts  ▪   Exceeding will require repeat procedure  ▪   E.g. 1° #1 = 105 RBC (5 RBC 3° sq.) 2° #2 = 85 RBC (5 RBC 3° sq.) Difference = 20  →  repeat procedure  •   Sample Problem 1 : Compute for the RBC count if an  average of 576 RBC is counted in the 5 tertiary RBC squares of the central secondary squares of both counting area of the hemacytometer. The dilution is 1:200.  o   # of cells counted: 576  o   Dilution: 1:200  o   Area: 0.04mm x 5 = 0.2mm  o   Depth: 0.10mm 

            •   Sample Problem 2:  Compute for the WBC count if an  average of 201 WBC is counted in the 4 secondary WBC squares of both counting area of the hemacytometer. The dilution is 1:20.  o   # of cells counted: 201  o   Dilution: 1:20  o   Area: 1.0mm x 4 = 4.0mm  o   Depth: 0.10mm