Immunology and Serology - 07 Introduction To Serological Tests

          IMMUNOLOGY AND SEROLOGY  INTRODUCTION TO SEROLOGICAL TESTS   OUTLINE  •   Bacterial Diseases  o   Syphilis  o   Typhoid Fever  o   Rickettsial Diseases  o   Other Bacterial Diseases  •   Viral Diseases   o   Viral Hepatitis  o   Infectious Mononucleosis  o   HIV/AIDS  o   Dengue  o   Other Viral Diseases    •   Parasitic and Fungal Diseases   o   Amoebiasis  o   Toxoplasmosis  o   Fungal Diseases  •     BACTERIAL DISEASES  SYPHILIS  •   Sexually transmitted disease caused by  Treponema pallidum  •   Transmitted directly from one host to another  o   90% is through sexual contact  o   10% - non-genital transmission (blood transfusion, needle injury)  •   Stages of Syphilis  o   Primary stage  - chancre  o   Secondary stage  - rashes, lymphadenopathy,  condyloma latum  o   Latent stage  - asymptomatic  o   Tertiary stage  - gummata  •   Comparison of Syphilis    Antigens  Antibodies  Tests   Non-treponemal/ Nonspecific  Wasserman ag (Cardiolipin)  REAGIN (anti-cardiolipin)  VDRL  RPR  Treponemal/ Specific  •   Treponemal  Group antigens - REITER CHON   •   Specific  T.pallidum antigens (pathogenic)  •   Group Abs- anti-Reiter CHON   •   Specific  T.pallidum antibodies-anti-T.pallidum abs  •   TPI  •   FTA-ABS  •   MHA-TP  •   TPHA  •      NON-TREPONEMAL MTDS  •   Used to detect Reagin (a substance present in the serum of individuals with certain diseases including syphilis)  •   VDRL  o   uses heated serum (@56ºC for 30 min.) as specimen and result is read microscopically; heating is done to deactive/destroy proteins/complement  o   Principle: Flocculation (aggn of colloidal particles)  o   Colloidal suspensions + reagin (+) flocculation of lipoids  o   Rgt Ag: colorless alcoholic soln containing cardiolipin, lecithin, cholesterol  o   Rotator: 180 rpm for 4 minutes  o   (+) Reactive  o   (-) Nonreactive  o   false (+) VDRL results : SLE, Rheumatic fever, IM, malaria, pregnancy  o     •   RPR Test  o   uses unheated serum as specimen and the result is read macroscopically  o   uses the incorporation choline-chloride to modify the basic VDRL Ag and allows testing of plasma without preliminary heating  o   Principle: Flocculation  o   Rgt Ag: colorless alcoholic soln containing cardiolipin, lecithin, cholesterol with charcoal  o   Rotator : 100 rpm for 8 minutes  o   Macroscopically read  o   False (+) RPR results: IM, leprosy, Rheumatoid arthritis  o    *not recommended for CSF    TREPONEMAL MTDS/SPECIFIC MTDS  •   T. pallidum Immobilization Test (TPI)  o   Most specific for syphilis  o   Principle: The Ab produced against T. pallidum plus complement can IMMOBILIZE the LIVE Treponemes.  o   Rgt Ag: live actively motile T pallidum organisms (extracted  from lesions of infected rabbits)  o   Ab: px syphilitic serum  o   Complement: guinea pig complement  o   (+) result : immobilization of treponemes (>50%immobile)  •   Fluorescent Treponemal Antibody Absorption Test (FTA-ABS)  o   Principle: fluorescence; complement fixation  o   Rgt Ag: Dead T. pallidum (Nichol’s strain) dried and fixed on  slide  o   Ab: px’s syphilitic serum  o   Absorbent: Reiter treponemes  o    *Px serum is prediluted in a heated culture filtrate of Reiter Treponemes so that group Abs are blocked and the specific  Ab will be then free to bind with the treponemal Ag.  o   Conjugate : Fluorescent-labeled AHG  o   (+) result: Fluorescence 

          o     •   T. pallidum Hemagglutination Test (TPHA)/ Hemagglutination Treponemal Test for Syphilis (HATTS)  o   Principle : Hemagglutination  o   Rgt. Ag: glutaraldehyde stabilized turkey RBC coated with treponemal antigen  o   Ab: px’s syphilitic serum  o   (+) result - hemeaggln  •   Microhemagglutination T. Pallidum Test (MHA-TP)  o   Principle : Hemeaggln  o   Rgt Ag: tanned formalin sheep RBC coated with treponemal antigen  o   Ab: px’s syphilitic serum  o   (+) result - hemeaggln  TYPHOID FEVER  •   Caused by Salmonella typhi  •   Fecal-oral route  •   Antigenic molecules used in serotyping  o   H antigen  o   K antigen  o   O antigen  •   Widal Test for Typhoid Fever  o   Principle: Direct Agglutination  o   Interpretations:  ▪   O means Typhoid Fever.  ▪   O and H means Typhoid Fever.  ▪   H means Past Infection, Convalescence, Exposure and Recent Immunization.  ▪   O, H, and PARA A means Typhoid and Paratyphoid Fever (Mixed Infection)  ▪   PARA A, B, and C means Paratyphoid Fever  RICKETTSIAL DISEASES  •   Causes Rocky Mountain Spotted Fever  •   Caused by Rickettsia rickettsii  •   Weil-Felix test  o   OX-19 (+) and OX-2 (+)  o   OX-K (-)  •   Weil-Felix reaction   – A Heterophile agglutination Test  o   A Weil-Felix reaction is a type of agglutination test in which patients serum is tested for agglutinins to O antigen of certain non-motile Proteus and rickettsial strains(OX19, OX2, OXk)  o   OX19, OX2 are strains of Proteus vulgaris. OXk is the strain of Proteus mirabilis.    OTHER BACTERIAL DISEASES  LEPTOSPIROSIS  •   Caused by Leptospira interrogans  •   Direct contact transmission via urine from infected animal  •   Two-stage disease  o   Septicemic stage  o   Immunological stage  STREPTOCOCCAL INFECTIONS  •   Causative agent - Streptococcus pyogenes  •   Untreated streptococcal pharyngitis may lead to rheumatic fever  •   Virulence factors  o   M protein  o   Streptokinase, hyaluronidase  o   Streptococcal pyrogenic exotoxins  VIRAL DISEASES  VIRAL HEPATITIS  HEPATITIS A  •   Infectious hepatitis  •   Caused by Hepatitis A virus (Picornaviridae)  •   MOT: fecal-oral route     •   Most common cause of hepatitis     •   Laboratory Diagnosis : RIA & ELISA - detect the  presence of specific HAV Abs  HEPATITIS B  •   Serum hepatitis  •   MOT: blood transmissible  •   Caused by Hepatitis B virus (Hepadnaviridae)  •   Found in blood, saliva, semen and breastmilk  •   Hepatitis B antigens  o   HBsAg  o   HBcAg - undetected serologically  o   HBeAg  •   Tests Available for HBV Detxn  o   1st Generation Test  ▪   Ouchterlony  •   Principle: Precipitation  o   2nd Generation Tests  ▪   Counter Immunoelectrophoresis (CIE)  •   Principle: Precipitation with Current  ▪   Rheophoresis   •   Principle: Precipitation by Evaporation  ▪   Complement Fixation   o   3rd Generation Tests  (Most Sensitive)  ▪   Reverse Passive Latex Agglutination  •   Principle: Agglutination  •   AntiHBsAg artificially/passively attached to latex particles  ▪   Reverse Passive Hemeagglutination  •   Principle: Hemeagglutination  •   AntiHBsAg passively attached to red cells  ▪   ELISA  ▪   RIA   

          INFECTIOUS MONONUCLEOSIS (IM)  •   Aka kissing’s diseases  •   Caused by Epstein Barr virus  •   Causes glandular fever  •   EBV antigens  o   viral capsid antigens (VCA)  o   EBV nuclear proteins (EBNA)  o   EBV early antigens (EA)  TESTS FOR IM  •   Paul Bunnel Test  o   Principle: HEMEAGGLUTINATION  o   Presumptive/screening test  o   Incapable of determining specificity and is only indicative of presence or absence of heterophil Abs  o   Rgt Ag: 2% suspension of SHEEP rbcs  o   Ab: heterophil Abs in px’s serum  o   (+) result: Hemeaggln- presence of Heterophil Abs  •   Davidson Differential Test  o   Principle: Absorption-Hemagglutination  o   Exposure of Test Serum to both Beef cells and Guinea pig cells which causes absorption of either one or both of these antibodies.  o   Ag: Guinea Pig Kidney cells and Beef rbcs  o   Ab: heterophil Abs in px’s serum  o   Indicator cells: Sheep RBCs  •   Monospot  o   Principle: ABSORPTION-HEMEAGGLUTINATION  o   Ag: Ag: Guinea Pig Kidney cells and Beef rbcs  o   Ab: heterophil Abs in px’s serum  o   Indicator cells: Horse RBCs  •   Rapid Differential Slide Test using Papain-Treated Sheep RBCs  o   Principle: Hemeagglutination  o   When papain is added to sheep cells, the receptors for the Abs are specifically inactivated.  o   Papain - inactivates abs for IM    HIV/AIDS  •   Causative agent of HIV infection  •   Family: Retroviridae  •   Has a marked preference for T-helper/inducer lymphocytes (CD4+) which serves as the receptor sites for the virus  •   Modes of Transmission  o   sexual contact  o   blood transfusion  o   parenteral injection  o   transplacental  o   breastfeeding  o   passage through infected birth canal  TESTS TO DETECT HIV ANTIBODY  •   Screening Tests  o   ELISA   (INDIRECT)   ▪   most widely used screening test for HIV antibodies  o   ELISA  ( Competitive Assay)   o   Slide Agglutination Tests  (Passive Aggln)  o   RIA  •   Confirmatory Tests  o   Western Blot Assay  ▪   Most widely used supplementary test for confirming reactive HIV ELISA Ab test  ▪   (+) result - if, gp41 band appears alone or when an envelope Ab(gp41, gp120 or gp160) appears in combination with another HIV band.  ▪   (-) result - if no bands appear  o   Indirect Immunofluorescent Assay (IFA)  •   Tests for Detecting HIV Genes  o   In situ hybridization  o   Filter hybridization  o   Southern Blot Hybridization  – DNA  o   DNA Amplification  o   PCR  – tests HIV RNA  o   Northern Blot  – measures mRNA antigen  DENGUE  TESTS FOR DENGUE  •   IgM Antibody Capture Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (MAC-ELISA)  o   Qualitative detection of dengue virus IgM antibodies  o   Interpretation of results  ▪   Positive IgM: Patients with a positive IgM test result are classified as presumptive, recent dengue virus infections.  •   Plaque Reduction Neutralization Test (PRNT)  o   Detect specific neutralizing antibodies against dengue virus and other flaviviruses  o   Measures the titer of the neutralizing antibodies in the serum of the infected person  OTHER VIRAL DISEASES  CYTOMEGALOVIRUS (CMV)  •   member of Herpesviridae family  •   gold standard test is viral culture  RUBELLA VIRUS  •   caused by RNA virus that belongs to Togaviridae family  •   causative agent of german measles  •   Three viral structural proteins  o   E1  o   E2  o   nucleocapsid protein C        

          PARASITIC AND FUNGAL DISEASES  AMOEBIASIS  •   Entamoeba histolytica , major pathogenic parasite for  humans  •   Fecal-oral route  •   Common complication - dissemination to the liver   •   Serological Tests:  o   Gel diffusion precipitin test (GDP)  ▪   Commercially available, simple to perform, and inexpensive  o   IHA and EIA tests  ▪   • EIA for Entomoeba histolytica antibody detection  ▪   • IHA for routine serodiagnosis of amebiasis  o   Conventional PCR  ▪   Method of choice for discriminating between the E. histolytica and E. dispar  o   Real-Time PCR  ▪   A TaqMan real-time PCR approach has been validated at CDC and is used for differential laboratory diagnosis of amebiasis  TOXOPLASMOSIS  •   Toxoplasma gondii is a protozoan parasite that infects most species of warm blooded animals, including humans, and can cause the disease toxoplasmosis.         •   Definitive host - cat  •   Intermediate host - man and other mammalian species  •   Serologic test , primary mode of diagnosis  o   IFA and EIA tests  for IgG and IgM antibodies  ▪   Most commonly used  o   Toxoplasma-specific IgA antibodies  ▪   More sensitive than IgM detection in congenitally infected babies  o   TORCH test   •     FUNGAL DISEASES  •   Available technologies include:  o   Immunodiffusion (ID)  o   Complement fixation (CF)  o   Enzyme immunoassay (EIA)   REVIEW  BACTERIAL DISEASES  •   Syphilis  o   Non-treponemal tests  ▪   Flocculation  ▪   Complement fixation  ▪