Clinical Chemistry Lab - 03 Spectrophotometry

  CEU Malolos BSMT 2023    CC1L - M5  • 1    CLINICAL CHEMISTRY LABORATORY  INSTRUMENTATION: SPECTROPHOTOMETRY    OUTLINE  •   Introduction  o   Analytical method  o   Colorimetry  •   Spectrophotometry  o   Principles  o   Types of Spectrophotometry  o   Introduction  o   Spectrophotometry  o   Components of a Spectrophotometer    •     INTRODUCTION  ANALYTICAL METHOD  •   Light energy, wavelength and radiant energy spectrum  •   Energy  - is transmitted via electromagnetic waves that are  characterized by their frequency and wavelength.   •   Wavelength-  is the distance between 2 successive peaks  and it is expressed in term of nanometer (nm)  o   400-700 nm- visible spectrum  o   <400 ultraviolet region  o   >700 infrared region  •   Frequency - is the number of vibrations of wave motion  per second.  COLORIMETRY   •   Photoelectric Colorimetry  o   The primary analytical utility of spectrophotometry is the isolation of discreet portions of the spectrum for purpose of measurement  •   Spectrophotometric measurement- measurement of light intensity in narrower wavelength  •   Photometric measurement- measurement of light intensity  SPECTROPHOTOMETRY  PRINCIPLE  •   Spectrophotometry takes advantage of the property of colored solutions to absorb light of specific wavelength.  •   Measure light intensity as a function of wavelength  •   It diffracts the light beam into a spectrum of wavelengths, detecting the intensities with a charge-coupled device, and displaying the results as a graph on the detector and then on the display device  TYPES OF SPECTROPHOTOMETRY  •   Single Beam  •   Double Beam  o   Double-beam in space  o   Double-beam in time      INTRODUCTION  •   Light  is a form of electromagnetic energy  o   Transmitted via electromagnetic waves  o   Waves is measured in nanometer between the peaks and valleys (wavelength).    •   Beer’s Law  o   The concentration of a substance is:  o   Directly proportional to the amount of light absorbed  o   Inversely proportional to the amount of transmitted light  o   Formula: A = 2 - log %T  SPECTROPHOTOMETRY  •   Measures the light transmitted by a solution to determine the concentration of the substance in the solution    COMPONENTS OF A SPECTROPHOTOMETER  1.  Light Source 2.  Entrance Slit 3.  Monochromator 4.  Exit Slit 5.  Sample cell 6.  Photodetector     

  CEU Malolos BSMT 2023    CC1L - M5  • 2    LIGHT SOURCE  •   Provide incident light for the system  •   Incandescent Tungsten or Tungsten iodide lamp  o   For visible and near infrared region spectrum (320 to 700nm)  •   Deuterium-discharge lamp and Mercury arc lamp  o   For UV spectrum (below 350nm)  •   Silicone carbide  o   For infrared spectrum    ENTRANCE SLIT  •   Minimizes unwanted or stray light  •   Prevents the entrance of scattered light into monochromator system.  •   Exclude unwanted or “stray light  MONOCHROMATOR  •   Isolates specific wavelength from the light source  •   Interference Filter -  Based on constructive interference of  waves  •   Prism -  Separates white (visible) light into a continuous  spectrum.  •   Diffraction gratings  o   Bends light and form wave fronts. Light that are in phase reinforce one another, if not it cancels out  o   Used for UV, visible or infrared measurements    EXIT SLIT  •   Controls the width of the light beam  SAMPLE CELL  •   Also known as cuvette or analytical cell  •   Holds the solution of which absorption is to be measured  •   Glass cuvette -  for visible range  •   Quartz or fused silica -  for UV range    PHOTODETECTOR  •   Converts transmitted radiant energy into an equivalent amount of electrical energy.  •   Photocell  (Barrier layer cell, selenide cell)  o   Generates electromotive force (no external voltage)  o   Output is not amplified  •   Phototube  o   Similar to photocell but requires external voltage  •   Photomultiplier tube  o   Detects and amplifies radiant energy (200x sensitive)  •   Phototransistors and Photoiodide  o   Uses a photosensitive positive-negative junction diode to produce a photocurrent.          READ-OUT DEVICE  •   A moving needle on a dial or a digital display which indicates the amount of light passing through a sample.     

  CEU Malolos BSMT 2023    CC1L - M5  • 3    SPECTROPHOTOMETRY (DISCUSSION)  SPECTROPHOTOMETRY  •   Spectroscopic method that studies the realtionship between light and a matter  o   Diffferent substance emit and absorbs different wavelengths of light  •   Most commonly used analytical method in clinical chemistry  •   Measures the absorbance of a substance by measuring the amount of light that is not absorbed (% Transmittance)    o   Absorbed light - light that do not pass through  o   Transmitted light/transmittance (I t )- light that passed  through the substance  o   Incident light (I 0 )- light that strikes the sample  o   %T = It / I0 x 100       PARTS OF SPECTROPHOTOMETRY    •   Light source    o   Provides polychromatic light (light with all visible spectrum of wavelengths  o   Most improtant part  ▪   Without light, absorbed light & transmitted light cannot be measured  o   Monochromatic light should be narrowed  •   Entance slit  o   Aka Collimator  o   Minimizes stray light (unwanted light, light not from light source)  o   Collimates the polychromatic light  ▪   Arrange the wavelength in parallel before it passes through monochromator  •   Monochromator  o   Isolates specific wavelengths from polychromatic light  o   Allows light to pass through the exit slit  •   Exit slit  o   Aka wavelength selector  o   Will only allow the specific/selected wavelength to reach the sample  o   Adjustable for specific wavelengths  •   Incident light  (I 0 ) - light that strickes the sample  •   Cuvette  o   Analytical cell  o   Contains the sample  o   Only utilizes one type (standardizes) of dimension of cuvette  ▪   Absorbance is also directly proportional to the light path  ▪   Short path = low absobrance  ▪   Long path = high absorbance  •   Transmitted light  (It) - light passed through the sample in  the cuvet  o   Converted into phtoelectric energy by the action of photodetector  •   Photodetector  o   Converts light into energy  •   Read-out device  o   Visualizes converted energy    BEER LAW  •   The absorbance of a substance is directly proportional to its concentration  •   A = εlc  o   ε - molar concentration absorbdibity (varies per subs.)  o   l - light path  o   c - concentration of sample  •   Alternative method is getting absorbance of different concentrations of specific solutions