Clinical Chemistry Lab - 05 Lipid and Lipoprotein Methodologies

          CLINICAL CHEMISTRY LABORATORY  LIPID AND LIPOPROTEIN METHODOLOGIES   OUTLINE  •   Cholesterol Methodologies  o   Notes to Remember  o   Chemical Methods  o   General Methods  o   Colorimetric Non-Enzymatic Method  o   Enzymatic Methods  o   CDC Reference Method  o   Clinical Significance   •   Triglyceride Methodologies   o   Notes to Remember  o   Chemical Methods  o   Enzymatic Method  o   CDC Reference Method  o   Clinical Significance     •   Lipoprotein Methodologies  o   Notes to Remember  o   Patient Preparation  o   Ultracentrifugation  o   Electrophoresis  o   Polyanion Precipitation  Method  o   HDL  o   LDL  o   Other Methods   LIPID & LIPOPROTEIN METHODOLOGIES  •   Important in assessing risk for atherosclerosis which may lead to myocardial infarction  •   Lipid profile  o   Measured in laboratory for lipid & lipoproteins determination  o   Includes:  ▪   Cholesterol  ▪   TAG  ▪   Lipoprotein (VLDL, LDL, HDL)  CHOLESTEROL METHODOLOGIES  •   Cholesterol   o   Most atherogenic  ▪   Not metabolized as energy  ▪   Majority of cholesterol in synthesized by liver  •   Diet is not a significant factor in cholesterol management  ▪   Can be transported to lived by LDL  •   Can be deposited to blood vessels  NOTES TO REMEMBER  •   Total cholesterol is measured (CE + FC/HDL-C, LDL-C)  o   Total cholesterol including lipoproteins  •   Sample : 12-hour fasting serum or plasma (not necessary)  o   Fasting has little effect  o   EDTA : preferred anticoagulant  •   Increases with age : 2 mg/dL/year (45-65 years old)  •   Two weeks prior to testing: patient is on usual diet, no restrictions in diet & activity  •   Recommendation :  o   Initial screening for lipid profile: age 20 or above  ▪   Should be repeated at least once every 5 years   CHEMICAL METHODS  •   Dehydration and oxidation of cholesterol to form a colored compound (colorimetric method)  o   The presence of double bonds and hydroxyl group in the sterol’s structure makes it possible for cholesterol to carry out a colorimetric assay.  ▪   Binds chromogenic agents to form color    •   Variables :  o   Hemolysis : falsely increased  o   Icteric : 5mg to 6mg increase in cholesterol per mg of  bilirubin  ▪   Bilirubin interferes with TC measurement (absorbs light @ 500nm)  ▪   Icteric - dark yellow to orange discoloration of plasma/serum due to high bilirubin  GENERAL METHODS   •   Only method in CC involving multiple steps*  •   One-step Method  (Pearson, Stern and Mac Gavack)  o   Colorimetry  •   Two-step Method  (Bloors)  o   Extraction + Colorimetry  •   Three-step Method  (Abell-Kendal Assay)  o   Saponification + Extraction + Colorimetry  o   Most commonly used method    •   Four-step Method  (Schoenheimer, Sperry, Parekh, Jung)  o   Precipitation (acid soln) + Saponification + Extraction + Colorimetry  COLORIMETRIC NON-ENZYMATIC METHOD   •   End-product do not use enzymes   •   Liebermann Burchardt Reaction  o   Acetic anhydride test  o   Most commonly used chemical method/colorimetric non-enzymatic method (colorimetric assay)    o   Sodium sulfate : end color stabilizer  ▪   Used because end color may fluctuate  •   Salkowski Reaction    COLORIMETRIC ENZYMATIC METHODS  CHOLESTEROL OXIDASE METHOD  •   H 2 O 2  produced is proportional to amount of cholesterol.  •   Measures free cholesterol (Hydrolyzation of CE to cholesterol is needed to measure CE)  •   Advantages :  o   Microliter amount of sample  o   Do no require preliminary extraction step; short time  •   False increase : gross hemolysis  •   False decrease :  o   Hemoglobin   – pseudoperoxidase activity may  consume H 2 O 2   o   Bilirubin   – oxidized by H 2 O 2  losing its absorbance  ▪   5 mg/dL ↑ bilirubin = ↓ cholesterol (5-15%)  •   Chromogenic Agents  o   Provide color to H 2 O 2   o   Used agents  ▪   Phenol  ▪   4-aminoantipyrine  o      

            CDC REFERENCE METHOD  •   Abell, Levy and Brodie Method  o   Modification of Abell-Kendal Assay (3-step method)  o   Chemical method  o   Uses hexane extraction after hydrolysis with alcoholic KOH followed by reaction with Liebermann Burchardt color reagent.  o   Saponification (hydrolysis)  →  extraction (hexane)  →   colorimetry (Libermann-Burchardt)  CLINICAL SIGNIFICANCE  •   Increased Cholesterol  (hypercholesterolemia)   o   Hyperlipoproteinemia II, III, V  o   Biliary cirrhosis  o   Nephrotic syndrome  o   Poorly controlled diabetes mellitus  o   Alcoholism  o   Primary hypothyroidism  ▪   Thyroid hormones metabolize cholesterol  ▪   Reduced thyroid hormone = decreased cholesterol metabolism  = ↑ cholesterol  •   Decreased Cholesterol  (hypocholesterolemia)   o   Severe hepatocellular disease (most common cause)  ▪   Hepatic cirrhosis - total malfunction of liver  ▪   Deficient synthesis of cholesterol in liver  o   Malnutrition  o   Severe burns  o   Hyperthyroidism  ▪   Increased thyroid hormone = increased cholesterol metabolism  o   Malabsorption syndrome  ▪   Improper absorption of dietary cholesterol  TRIGLYCERIDE METHODOLOGIES  NOTES TO REMEMBER  •   Sample : 10-12 hr fasting serum or plasma (necessary)  o   If stored at -20  ̊C – warm sample to 37 ̊C before testing.  o   Fasting - no food intake, only water is allowed  ▪   TAG is mainly derived from diet  ▪   Recent food intake may increase TAG levels  •   Lipemia : >400 mg/dL TAG  •   Increasing with age : 2mg/dL/year (45-65 years old)  •   Most commonly used method is based on hydrolysis of TAG and measurement of glycerol    o   Glycerol measured is directly proportional to TAG  •   Interferences :  o   Bilirubin  – interferes both spectrally and chemically  o   Hemolysis  – may cause dilution of lipid (false ↓)  o   Ascorbic acid  CHEMICAL METHODS   •   Van   Handel & Zilversmith   – Colorimetric method  o   Uses spectrophotometry    •   Hantzsch Condensation   – Fluorometric method  o   Fluorochromes are added for fluorescence    ENZYMATIC METHOD  GLYCEROL KINASE METHOD  •   Universally used for TAG measurement  •   Involves hydrolysis of TAG to free fatty acids and glycerol, followed by phosphorylation of glycerol to glycerophosphate  o   glycerophosphate = glycerol-3-phosphate  o   glycerophosphate is proportional to TAG levels  •   Major interference :  o   Glycerol  (free glycerol)   ▪   Perform TAG blank to correct TAG values.  ▪   Can interfere or undergo phosphorylation  ▪   False increase in TAG measurement  •   Common step :    o   Hydrolyze  →  phosphorylate    •   Reaction A  o   The amount of NADH proportional to TAG  o   Measured at 500-600nm, spectrophotometrically    •   Reaction B  o   The amount of H2O2 is proportional to TAG  o   Measured at 500 nm, spectrophotometrically    •   Reaction C  o   Involves ADP rather than glycerophosphate  o   NADH consumption is measured at 340 nm.    TRIGLYCERIDE BLANKS  •   Free glycerol in serum may interfere w/ enzymatic methods  •   Not routinely performed (little practical importance)  •   Glycerol are normally present in serum (<1.5mg/dL) 

          •   <1.5 mg/dL free serum glycerol = ≈14mg/dL TAG  •   ↑ free glycerol : strenuous exercise, uncontrolled diabetes.  o   Diabetes - Inefficient metabolism of glucose  o   After exercise, non-carbohydrate energy source (TAG  →  Glycerol + fatty acids) are used  •   Blank Assay :  o   Removal of lipase in the reaction series to detect only free glycerol in the serum  o   Without lipase, triglyceride will not be hydrolyzed into glycerol and fatty acid  o   Therefore, only the free glycerol in the sample will be measured. The measured free glycerol is subtracted from the triglyceride measured. (corrected method)  CDC REFERENCE METHOD  •   Modified Van Handel and Zilversmith  o   Colorimetric chemical method  o   Cannot be automated (time-consuming)  o   Involves  alkaline  hydrolysis  (saponification)  using alcoholic KOH, solvent extraction with chloroform and the extract is treated with sicilic acid (chromatography) to isolate TAG, and a color reaction with chromotrophic acid gives rise to pink end color  o   Interfering substances are removed during extraction with chloroform.  ▪   Interfering subs. - bilirubin, Hgb, ascorbic acid  o   Sicilic acid   – remove phospholipids from the  chloroform extract.  CLINICAL SIGNIFICANCE  •   Increased Triglyceride  (hypertriglyceridemia)   o   Hyperlipoproteinemia  ▪   I, IIb, III, IV, V  o   Alcoholism  o   Nephrotic syndrome  o   Hypothyroidism  o   Pancreatitis  o   Diabetes mellitus  •   Decreased Triglyceride  (hyportriglyceridemia)   o   Malabsorption  o   Malnutrition  o   Hyperthyroidism  o   Brain infarction  LIPOPROTEIN METHODOLOGIES  •   Lipoprotein  o   Lipid transporters  o   Concentration assumes concentration of lipids  NOTES TO REMEMBER  •   Preferred sample : 10-12 hr fasting serum (SST)  o   SST  - serum separator tube  o   Fasting is unnecessary (Cholesterol & HDL)  •   EDTA plasma  can be used  o   Cholesterol and TAG concentration are 3% lower than serum  •   Cholesterol, TAG and HDL  can be used using frozen  sample.  o   Sample should be thawed first before analysis  •   Lipemia in non-fasting serum : hyperlipidemia, patient  under total parenteral nutrition therapy.  •   Lipoproteins  are differentiated based on electrophoresis  and buoyant density.  o   Basis of nomenclature  PATIENT PREPARATION  •   Fasting : 10-12 hours  o   Fasting state : TAG is present in VLDL  o   Non-fasting state : TAG is present in chylomicrons  ▪   Only Cholesterol and HDL can be measured using non-fasting sample.  •   Diet :  o   HDL and LDL   – declined after eating  •   Posture :  o   Patient should be seated for 5 minutes prior to collection  o   Standing to seating: extravascular fluid enters the vascular system causing hemodilution  ▪   10% decrease (TC, HDL, LDL, Apo-A1, Apo-B) is observed after 20-minute period of seating  ULTRACENTRIFUGATION  •   Reference method for quantitation of lipoproteins  •   Basis of the classical term for different lipoproteins  •   Fractionation of lipoproteins based on density.  o   Density of lipoprotein is based on their protein and TAG content.  •   Reagent : Potassium bromide solution (1.063 density)  •   Frozen sample should not be used!  o   TAG-rich LPP do not withstand freezing    ELECTROPHORESIS  •   Separation of lipoprotein based on their net charge.  •   Basis of the nomenclature due to electrophoretic pattern  •   Electrophoretic pattern :   o   Origin  (point of application): Cathode (-)  o   HDL  -  α-band – most anodal (+)  o   VLDL  -  between α2 and β band ; 2 nd  most anodal  o   LDL  -  β band; least anodal  o   Chylomicrons -  remains in the origin   ▪   No electrophoretic pattern   o   IDL  - may migrate to beta or pre-beta region  o   Lp(a)  - migrate toward pre-beta region  o   Lipoprotein X  - only migrate toward the cathode  o   β-VLDL  - migrate with LDL  •   Support Medium :   o   Agarose Gel   •   Staining dyes :   o   Oil Red O, Fat Red 7B, Sudan Black B   ▪   Reacts with the ester bonds in TAG and CE 

            POLYANION PRECIPITATION METHOD  •   Only measures one type of lipoprotein  •   Some lipoproteins are precipitated with polyanions and divalent ions  o   Polyanions : Heparin sulfate, dextran sulfate,  phosphotungstate  o   Divalent Ions : Mg 2+ , Ca 2+ , Mn 2+   •   Most useful lipoprotein test:  Enzymatic method + Precipitation method  HDL  •   Uses dextran sulfate (synthetic heparin) with magnesium (precipitant).  o   Precipitate Apo-B containing lpp (CM, LDL, VLDL)  •   Semi-automated analyzers: Sample are pre-treated with precipitant to remove other lipoproteins.  o   Most consistent analytical error in HDL assay is the presence of Apo-B containing lipoproteins  •   CDC Reference Method : 3-step method  1.  Ultracentrifugation   – removes VLDL & chylomicrons  2.  Precipitation  (heparin + Mg 2+ )  – removed remaining  Apo-B containing lipoprotein (LDL)  3.  Abell-Kendal Assay   – method for cholesterol analysis  •   Homogenous assay   – most popular method for HDL  analysis  o   Utilized by most fully-automated analyzers  o   Do not require pretreatment with precipitant.  o   First Reaction : reagent forms complex with non-HDL  lipoprotein  o   Second Reaction : releases HDL to be measured  enzymatically.  LDL  •   Carry cholesterol from liver to peripheral tissue  BETA QUANTIFICATION METHOD  •   Combination of ultracentrifugation and chemical precipitation.  •   Cholesterol is contained in the three major lipoproteins (HDL, VLDL, LDL)  o   Total Cholesterol  = HDL + LDL + VLDL  •   1st Step : ultracentrifugation to remove VLDL and CM  •   2nd Step : measure total cholesterol (HDL + LDL)  •   3rd Step : precipitation of LDL then measure HDL  •   LDL  = TC - HDL  HOMOGENOUS DIRECT LDL METHOD  •   Useful when TAG is elevated (600 mg/dL)  •   Uses two reagents:  o   First Reagent : selective removal of non-LDL lpp  o   Second Reagent : release of cholesterol from LDL  then measured enzymatically.  CALCULATION OF LDL  •   Indirect method of LDL quantitation  •   Widely used method in clinical laboratory  o   Incorporated in most fully automated analyzers  •   Two Formula :  o   Friedewald Formula   – most commonly used  o   De Long Formula  •   Limitations :  o   TAG >400 mg/dL  o   Presence of CM and β-VLDL  •   Friedewald Formula  o   General Formula :    •   De Long Formula  o   General Formula :    OTHER METHODS   •   Chromatography  o   Uses either Gel Chromatography or Affinity Chromatography.  •   Immunochemical methods  o   Uses antibodies specific to epitopes present on the lipoproteins.  •   Immunoassay/Immunonephelometry  o   Used for Apolipoprotein Assay  o   Utilizes antibody specific against specific apolipoprotein  o   An antibody-apolipoprotein complex in measured using nephelometry.  o   Studies have shown that Apo A1 and Apo B are better indicators of atherosclerotic disease than lipoprotein assay  o   Lp (a) is measured using immunoturbidimetry