Strain improvement by UV

AGM 312 Microbial Biotechnology (1+1)   Page 63    E xp er im en t  15  Strain improvement by UV mutagenesis  Date:       Replica Plate technique was developed by Joshua and Esther Lederberg in 1952 for  providing direct evidence for the existence of pre-existing mutations. This technique isolates both  nutritional  mutants  and  antibiotic-resistant  mutants.  Their  actual  experiment concerned with replicating master plates of sensitive cells to two or more plates containing either streptomycin or T1 phage.  Replica  plating  allows  the  observation  of  microbes  under  a  series  of  growth  conditions.  The  bacteria  are  grown  in  an  environment  that  is  not  selective  for  a  given mutation.  This  technique  is  used  to  transfer  the  members  of  each  colony  to  a  selective environment.  A  simple  velveteen  covered  colony  transfer  device  is  used  to  transfer  the colonies  in  nutrient  agar  medium  supplemented  with  or  without a  particular  antibiotic or nutrient.  The  fibers  of  velvet  act  as  fine  inoculating  needles,  picking  up  the  bacterial  cells from the surface of this master plate. The velvet with its attached microbes is then touched to  the  surface  of  a  sterile  agar  plate,  inoculating  it.  In  this  manner,  microbes  can  be repeatedly  stamped  onto  media  of  differing  composition.  By  comparing  the  presence  of colonies  following  incubation,  we  can  indirectly  determine  the  mutant  colonies  by  their absence in the selective environment. A colony that develops on a complete medium fail to develop on a minimal medium that lacks a specific growth factor (more often amino acid), the occurrence of a nutritional mutant  is indicated. The microbes that  do  not grow on the minimal medium represent auxotrophic strains.    Materials required:     24 h old nutrient broth culture of  Escherichia coli .     Minimal salt agar with glucose.     Three 10ml Nutrient agar deeps.  Procedure  Part I: Mutation of  E. coli  with UV radiation 

AGM 312 Microbial Biotechnology (1+1)   Page 64       Inoculate LB broth tube with  E. coli  and incubate it for 16 h at 37 ᵒ C     Dilute the overnight culture 100 fold into fresh LB broth and grow to a cell density of 2 x 10 8 cells per ml     Wash the bacteria by filtration or centrifugation and re ฀ suspend them in PBS to have  a cell density of 2 x 10 8  cells per ml     Plate 0.1 ml aliquot of 10 ฀ 5  dilution in duplicate on solid LB agar medium     Incubate the plates at 37 °C for 24 to 48 h     Observe the plates for the development of  E. coli  colonies     Count the no. of viable cells per ml prior to irradiation     Irradiate the culture of E. coli with UV to get UV induced mutant of the bacterium     Pipette 5  –  6 ml aliquot of bacteria suspended in PBS as prepared in step 3 above, at   2 x 10 8  cells per ml to sterile Petri dishes.      Remove the top of Petri dishes and place them on the shaker underneath the light source at a distance of 30 cm, and expose the plates for 15 to 20 min     Transfer 1 ml of UV treated culture in 10 ml nutrient broth and incubate overnight in stationary phase at 37 °C     Pipette 0.1 ml of the undiluted as well as 101 or 102 fold dilutions of cultures on to nutrient agar plates i.e. complete medium     Spread the organism over the plates with a sterile bent glass rod     Incubate this plates in an inverted position at 37 °C for 24 h  Part II: Screening auxotroph mutants by Replica Plate technique     Prepare agar medium with minimal medium with and without lysine     By holding the sterile colony carrier handle in the right hand, carefully lower the velvet surface and press on the master plate surface having colonies of  E. coli  both  wild type and mutant survivor  to pick up bacteria from each colony     Inoculate the minimal agar plate (i.e. complete medium minus lysine) by lightly pressing the velvet onto the medium to get a replica plate.     Now without returning the carrier to the master plate, inoculate the complete medium plate in the same manner     Incubate both the inoculated plates upside down at 37 °C for 48  ฀  96 h  Observation  Examine  both  the  minimal  agar  and  complete  medium  plates  for  the  appearance  of  E.coli   colonies and identify those which grew on complete medium but not on the minimal agar plates. Determine the location of lysine auxotroph on the complete medium replica plates.  Result and inference:     

AGM 312 Microbial Biotechnology (1+1)   Page 65                                        Reference:  S.Javed, M.Asgher, M.A. Sheikh and H. Nawaz. 2010. Strain Improvement Through UV and Chemical Mutagenesis for  Enhanced Citric  Acid Production in Molasses-Based Solid State Fermentation, Food Biotechnology, 24:2, 165-179, DOI: 10.1080/08905436.2010.482014