Streptomycin & Amylase Assay: Microbial Biotech

AGM 312 Microbial Biotechnology (1+1)   Page 37      E xp er im en t  8  Production of antibiotics  Date:     Secondary  metabolites  are organic  compounds that  are  not  directly  involved  in  the  normal growth, development, or reproduction of an organism. Unlike primary metabolites, absence of secondary metabolites does not result in immediate death, but rather in  a long-term impairment  of the organism's survivability, fecundity, or aesthetics, or perhaps in no significant  change  at  all.  Secondary  metabolites  often  play  an  important  role  in defense against  herbivory and  other  interspecies  defenses.  Humans  use  secondary  metabolites  as medicines, flavorings, and recreational drugs.   Antibiotics  (Greek word  -  antiviotika)  also  called  antibacterials ,  are  a  type  of antimicrobial drug used in the treatment and prevention of bacterial infections. They may either  kill or inhibit  the  growth of bacteria.  The  term  antibiotic  was  first  used  in  1942  by Selman  Waksman and  his  collaborators  in  journal  articles  to  describe  any  substance produced by a microorganism that is antagonistic to the growth of other microorganisms in high dilution.   Streptomycin  is  derived  from  the  bacterium  Streptomyces  griseus .  Streptomycin  has  three  constituents,  namely;  N-methyl  L-glucosamine,  Streptose,  and  streptavidin.  The present-day  streptomycin  producers  are  the  mutants  of  Streptomyces   derived  for  higher  yields with yield as high as 25,000 units per ml.  The industrial production of streptomycin is carried out using submerged fermentation processes.  The fermentation media consists of glucose,  starch,  dextrin,  soy  meal,  steep  corn  liquor,  sodium  sulfate.  The  streptomycin fermentation  requires  high  aeration  and  agitation.    The  fermentation  is  carried  out  at  28-30ºC with pH maintained at 7.6-8 for good productivity. The fermentation lasts for 5-7 days with the yield of 1-3 g/L of the fermentation broth.     Objective  To mass multiply streptomycin producing organism  Streptomyces griseus .   Materials Required:   Commercial production of streptomycin contains media with soybean meal, glucose,  and sodium chloride.    Kenknight’s Broth:   Dextrose  1.0 g  KH 2  PO 4   0.1 g  NaNO 3   0.1 g 

AGM 312 Microbial Biotechnology (1+1)   Page 38    KCl  0.1g  MgSO 4  0.1g   Distilled water   1000 ml  Procedure:  The streptomycin fermentation proceeds through three phases.    Fermentation :     In the first phase, the organism produces proteases that digest the soybean meal and release  ammonia  and  carbohydrates.  These  are  utilized  for  increasing  biomass. Glucose is slowly utilized, and the net production of streptomycin is low during this phase. The pH of the medium rises from 6.7 or 6.8 to 7.5 or higher. This phase lasts for 24h.      The  next  phase  is  the  idiophase  or  the  stationary  phase,  during  which  maximum streptomycin  (secondary  metabolite)  is  produced.  It  ranges  from  24h  to  6-7  days. Rapid utilization of ammonia and glucose occurs with no mycelial  growth, and pH during this phase remains relatively constant at 7.6 to 9.0.      In  the  last  phase  (death  phase)  the  sugars  have  been  completely  depleted  in  the medium,  and  streptomycin  production  ceases  completely.  The  ammonia  released due to the cell lysis raises medium pH. The fermentation broth is generally harvested before the last phase begins.    Recovery of Streptomycin      On  completion  of  fermentation,  the  mycelium  is  separated  from  the  broth  by filtration.      The  remaining  liquid  is  then  percolated  through  cation  exchange  resin  columns where  streptomycin  gets  adsorbed  and  is  finally  eluted  by  washing  with  buffer  as streptomycin sulfate.     Further impurities are removed by treating it with sodium hypochlorite, EDTA, and activated carbon.     The purified streptomycin sulfate solution is concentrated under vacuum and dried aseptically.       

AGM 312 Microbial Biotechnology (1+1)   Page 39    Flow chart for Streptomycin production      Work Done:   PHASE I  • Initial fermentation phase - little streptomycin production • Rapid growth with production of mycelial biomass • Proteolytic enzyme activity of  S. griseus  relases ammonia and raised pH  of media to 7.5 PHASE II • Additional production of mycelium occurs • Streptomycin accumulates in the medium • pH remains fairly constant ranging between 7.6 to 8.0 PHASE III • Final fermentation phase • Streptomycin production ceases and bacterial cells begin to lyse. • Ammonia from lysed cells increase the pH

AGM 312 Microbial Biotechnology (1+1)   Page 40    Review Questions  1.   Who discovered streptomycin?       2.   What is the mode of action of streptomycin?       3.   Write the range of the target organisms of streptomycin?            4.   What are the other methods for testing the antibiotic activity of microorganisms?           5.   What is MIC?            6.   List the common solvents used for extraction in downstream processing.       

AGM 312 Microbial Biotechnology (1+1)   Page 41           7.   Differentiate upstream and downstream processes.                8.   Why is down streaming important?                      Reference  Najafpour,  Ghasem.  (2007).  Production  of  Antibiotics.  In:  Biochemical  Engineering  and Biotechnology. DOI: 10.1016/B978-044452845-2/50011-2.   

AGM 312 Microbial Biotechnology (1+1)   Page 42      E xp er im en t  9  Assay of amylase and antibiotics   Date:    Down  streaming  refers  to  the  recovery  and  purification  of  biosynthetic  products,  particularly  pharmaceuticals  such  as  antibiotics,  hormones,  etc.  Among  the  three  steps  of any  fermentation  process  viz.,  upstreaming,  fermentation,  and  down  streaming,  down  streaming  is  the  most  critical  step  involving  the  recovery  of  the  product  and  decides  the economy of the final product. Down streaming involves the following four steps:    1.   Removal  of  insoluble   is  the  first  step  and  involves  the  capture  of  the  product  as  a  solute  in  a  particulate-free  liquid.  Typical  operations  are  flocculation,  floatation, filtration, centrifugation, sedimentation, and precipitation.   2.   Product  isolation   is  the  removal  of  those  components  whose  properties  vary  markedly  from  that  of  the  desired  product.  Eg.  Solvent  extraction,  adsorption, ultrafiltration, and precipitation.   3.   Product purification  is the removal of those contaminants that resemble the product  very  closely  in  physical  and  chemical  properties.  Eg.  Chromatography, crystallization, or fractional precipitation.    4.   Product polishing  describes the final processing step and ends with the packaging of  the product in a form that is stable, transportable in a convenient way.  ASSAY OF AMYLASE  Objective    To extract amylase enzyme and antibiotic streptomycin and test its activity.  Principle:  The  reducing  sugars  produced  by  the  action  of  α  and  β  amylase  react  with  dinitrosalicylic acid and reduce it to a brown colored product, nitroaminosalicylic acid.  Materials:  1.   Sodium acetate buffer, 0.1 M pH 4.7  2.   Starch 1% solution (Prepare a fresh solution by dissolving 1 g starch in 100 ml acetate buffer, if necessary)  3.   Dinitro  salicylic  Acid  reagent  (Dissolve  by  stirring  1g  dinitrosalicylic  acid,  200  mg crystalline phenol, and 50 mg sodium 42sulfite in 100 ml 1% NaOH. Store at 4ºC.   4.   40 % Rochelle salt solution 

AGM 312 Microbial Biotechnology (1+1)   Page 43    5.   Maltose solution: Dissolve 50 mg maltose in 50 ml distilled water in a standard flask and store it in a refrigerator.  6.   Extraction of Amylase  Extract  the  sample  material  with  5-10  volumes  of  ice-cold  10mM  calcium  chloride  solution  overnight  at  4ºC  or  for  3  h  at  room  temperature.  Centrifuge  the extract at 54,000g at 4 ºC for 20 min.  Procedure:     Pipette  out  1  ml  of  starch  solution  and  1ml  of  the  adequately  diluted  enzyme  in  a   test tube     Incubate it at 27ºC for 15 min     Stop the reaction by the addition of 2 ml of dintrosalicyclic acid reagent     Heat the solution in a boiling water-bath for 5 min.     While the tubes are warm, add 1 ml potassium sodium tartrate solution      Then cool it in running tap water     Make up the volume to 10ml by addition of 6 ml water     Read the absorbance at 560 nm.     Terminate the reaction at zero time in the control tubes.     Prepare a standard graph with 0-100 µg maltose.  Calculation:    A  unit  of  α   or  β  amylase  is  expressed  as  mg  maltose  produced  during  5  min  incubation with 1% starch.  Observation:     Examine  the  plates  for  the  starch  hydrolysis  around  the  line  of  growth  of  each organism,  ie.,  the color change of the medium.       Estimate the amylase production.      Record the results in a table and discuss.    II. Streptomycin assay Materials required  1.   10 days old culture of  Streptomyces  sp. grown in Ken  knight‟s broth   2.   Test organisms  viz., Bacillus, E.coli  and  Xanthomonas  (24 h old)  3.   Solvent (Diethyl ether/ diethyl acetate)  4.   Separating funnel  5.   Sterile Petri plates  6.   Micropipette (20-200 µl)  7.   Sterile distilled water  8.   Standard antibiotic (Streptomycin)  9.   Ken knight‟s broth   10.   Sterile cork borer  

AGM 312 Microbial Biotechnology (1+1)   Page 44    PROCEDURE:  a.   Extraction of antibiotic     Prepare Ken  knight‟s broth, sterilize, inoculate with  Streptomyces  sp. and incubate for  10 days (till it attains stationary phase to ensure antibiotic production)     Filter the culture broth to separate the filtrate from the organism      Take the filtrate containing the antibiotic (Streptomycin)  in a separating funnel     Add an equal volume of the solvent Diethyl ether (1:1)     Mix them thoroughly by vigorous shaking for 15  -20 minutes. This is to extract and bring the antibiotic present in the filtrate completely into the solvent.     Leave  the  funnel  for  about  5-10  min  to  separate  the  solvent  (upper  layer)  and  the solute phase (lower layer).     Drain  the  solute  phase  at  the  bottom  of  the  funnel  and  retain  the  solvent  phase containing the antibiotic for testing its efficiency against different bacterial cultures.   b.   Testing the efficiency of the extracted antibiotic (Agar Well Diffusion Assay)     Prepare sterile nutrient broth in three separate flasks and inoculate the test organisms  viz., Bacillus, E.coli,  and  Xanthomonas      Allow the organisms to grow for 24 h till they attain a log phase.     Prepare sterile nutrient agar medium in three separate conical flasks.     To seed the medium, inoculate the 24 h grown test cultures @ 1% separately into each flask  containing  the  medium  at  bearable  warmth  condition.    Swirl  the  medium  for uniform mixing of the cultures.       Pour the medium seeded with the test cultures immediately into sterile  Petri plates, and allow for solidification.  Label the respective plates.     In  each  of  the  plates,  make  four  small  wells  equidistant  from  one  another  using  a sterile cork borer      Add 20 µl of the extracted antibiotic into the first and second wells; 20 µl of standard antibiotic  (streptomycin  50  ppm)  into  the  3 rd   well  (positive  control)  and  20  µl  of  sterile distilled water into the 4 th  well which serves as the negative control.     Incubate for about 2 days     Observe the plates for the formation of inhibition zones produced around each well and measure the zone of inhibition.  Record the results and interpret. 

AGM 312 Microbial Biotechnology (1+1)   Page 45    Work Done:                                               Reference  W.  W.  Windish  and  N.  S.  Mhatre,  “Microbial  amylases,”  in  Advances  in  Applied  Microbiology, W. U. Wayne, Ed., pp. 273 – 304, Academic Press, New York, NY, USA, 1965.  Kabay A. (1971). Rapid quantitative microbiological assay of antibiotics and chemical  preservatives of a nonantibiotic nature.  Applied microbiology ,  22 (5), 752 – 755.